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隨著發(fā)光(luminescence)技術在多種生物實驗中的廣泛應用，生物發(fā)光(bioluminescence)技術越來越成為的生物檢測手段。在這篇文章中，我們將詳細討論生物發(fā)光技術在生物檢測中的應用，以及它與其它發(fā)光檢測手段相比所顯示出的優(yōu)點。
1 生物發(fā)光的特點
根據(jù)產(chǎn)生光子的能量來源不同，發(fā)光可分為以下四大類，一是熒光(fluorescence)：依靠光子發(fā)光；二是化學發(fā)光(chemiluminescence)：依靠化學能量發(fā)光；三是輻射發(fā)光：依靠放射性能量發(fā)光；四是電能發(fā)光：依靠電能量發(fā)光。其中，生物發(fā)光(bioluminescence)是依靠天然的酶促化學反應產(chǎn)生的能量而發(fā)光，屬于化學發(fā)光，它天然地存在于許多生物體內，例如螢火蟲、深海里的水母和一些細菌。目前，在生命科學研究中，應用的是熒光和化學發(fā)光。而生物發(fā)光作為化學發(fā)光的重要類別，也日益受到廣泛關注和應用。物質發(fā)光的機理是：分子首先受到激發(fā)，吸收能量，從穩(wěn)定的基態(tài)躍遷到不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)，而當它從激發(fā)態(tài)返回到基態(tài)時，能量就以光子的形式釋放出來(圖1)，檢測發(fā)出的光子就能確定發(fā)光分子的存在。發(fā)光技術能否在生物檢測中得到應用及其應用的范圍，在很大程度上取決于激發(fā)分子的能量來源。因為激發(fā)能量的來源不同，其產(chǎn)生的相對信號強度(信號對本底的相對值)則不同，對檢測器的靈敏度要求也不同。以生物發(fā)光和熒光為例：對于熒光來講，一方面，由于熒光的光子能量吸收效率高，分子可以釋放大量的光能，從而產(chǎn)生高強度的光信號，利于檢測；另一方面，這種高流量的激發(fā)光子有時會嚴重干擾光感檢測器發(fā)射光子的分析能力，同時也可能激發(fā)生物樣品本身含有的熒光團，而產(chǎn)生其它非特異的發(fā)射光，進而導致實驗本底過高。也正是由于熒光的這種特性，即報告基團中高強度的信號與高強度的實驗本底共存，使得其檢測相對信號強度的能力大大降低。對于生物發(fā)光來講，它與熒光形成鮮明對照，因為生物發(fā)光依靠天然的酶促化學反應發(fā)光，不需要引進外源的光能，所以應用生物發(fā)光作為檢測手段的報告基團的實驗本底很底。雖然生物發(fā)光的信號強度沒有熒光那么高，但由于其*的發(fā)光原理，生物發(fā)光可以比熒光敏感一百甚至一千倍以上。這是生物發(fā)光越來越成為很多生物研究領域的生物檢測手段的原因之一。
在實際應用時，需要反復權衡信號強度的要求和實驗本底的影響，以選擇*的檢測技術。在光子檢測能力比較低的情況下，實驗本底很大程度上取決于儀器檢測的對象，例如顯微鏡和流式細胞儀，由于需要檢測單個細胞光學信號的變化，對發(fā)射光信號的強度要求非常高，因此，熒光通常會成為這一類應用領域的。然而，當需要檢測大量的生物樣品的時候，對光子檢測能力的要求就會相應降低，對降低實驗本底的要求相應會增加，比如在檢測單個試管樣品、多孔培養(yǎng)板樣品，或者對器官(如老鼠器官)進行圖像分析的時候，生物發(fā)光因其低本底和高靈敏度而倍受歡迎。而且由于生物發(fā)光檢測器不需要使用光學濾片，從而為縮短樣品和檢測器之間的距離提供了可能，由此也更加提高了檢測的效率。生物發(fā)光的靈敏度可以達到10-20 mol，相當于6，000多個螢光素酶分子。對于一個有幾百個細胞的生物樣品來說，一個細胞里只要有幾個分子的螢光素酶就可以被檢測到。而且生物發(fā)光的高靈敏度使得它可以檢測的濃度范圍非常寬，大多數(shù)可以跨越6～8個數(shù)量級，而且現(xiàn)代生物發(fā)光檢測儀技術的更新也使得如此大跨度的檢測成為可能。另外，由于生物發(fā)光來源于天然生物體內的酶促化學發(fā)光反應，當將其引進生物樣品內的時候，對正常的生物活動不會添加太多負面影響。而且，因為螢光素酶的底物在反應時是被包裹在螢光素酶分子的內部，從而可以在zui大限度上保護正常的酶促發(fā)光反應不受外界的干擾。
2 生物發(fā)光作為報告基因的應用及其優(yōu)點
生物發(fā)光在生命科學研究中zui廣泛的應用是作為監(jiān)測基因轉錄活動的報告基因。其中，螢火蟲體內天然存在的螢光素酶通常是研究人員的。螢火蟲的螢光素酶是一個61kDa的單體蛋白，它主要催化作用于名為螢光素(luciferin)的螢光素酶底物，在有ATP和氧氣存在的條件下產(chǎn)生黃綠色的光(發(fā)射光波長是560 nm)。
當使用報告基因來監(jiān)測基因轉錄活性的時候，研究人員zui大的顧慮是引進外源的報告基因可能會影響正常的生物活性，尤其是當報告基因通常需要和生物體內自身細胞的分子活動相時，高濃度的外源基因會過分加重生物內部細胞活動的負擔，從而影響正常的生理活動，甚至造成不正常的生理現(xiàn)象。因此，盡量降低報告基因的濃度就成為研究成功的關鍵。以綠色熒光蛋白為例，它是一類天然存在的發(fā)光蛋白，由于它能產(chǎn)生高強度的發(fā)射熒光，所以可以獲得非常清晰、生動的顯微圖像，在單細胞生物圖像分析中已經(jīng)得到廣泛應用。但因為清晰圖像的產(chǎn)生通常需要綠色熒光蛋白高濃度表達，從而加重了生物內部細胞活動的負擔，使得綠色熒光蛋白不適合作為監(jiān)測基因轉錄活動的報告基因。所以在選擇合適的報告基因時，特別是和綠色熒光蛋白相比較之后，生物發(fā)光由于其低表達和高靈敏度使其在眾多的選擇中脫穎而出。
監(jiān)測基因轉錄活性要求報告基因能夠快速監(jiān)測目標基因細微的動態(tài)變化。細胞內報告基因的濃度取決于兩大動態(tài)過程：即蛋白合成過程(受基因轉錄活性的調控)和蛋白降解過程。如果蛋白降解過程很慢，則會使蛋白高度穩(wěn)定，從而會造成蛋白的本底表達水平過高，那么基因轉錄活性改變所產(chǎn)生的新蛋白的合成就不容易被檢測到。這樣一來，報告基因的表達就不能準確地反應基因轉錄活性的變化。實驗證明，在螢光素酶的序列上添加蛋白降解序列，如小鼠鳥氨酸脫羧酶(mouse ornithine decarboxylase， ODC)中富含脯氨酸- 谷氨酸- 絲氨酸- 蘇氨酸(proline-glutamate-serinethreoninerich，PEST)的序列，可以顯著地提高檢測技術的應答性，并且不會對檢測手段的靈敏度造成太大影響。與之相反，由于綠色熒光蛋白的高表達和高穩(wěn)定性，使得添加蛋白降解信號反而在很大程度上限制了檢測的靈敏度。
為了進一步提高檢測基因的效率，我們對螢光素酶基因序列的密碼子進行了優(yōu)化，使得它在多種哺乳細胞中的表達水平提高了5～10倍；同時，為了減少對基因的非特異性調控，我們也對螢光素酶的載體進行了優(yōu)化，去除了載體上哺乳動物轉錄因子結合序列的保守序列，從而大大降低了實驗的本底，顯著提高了實驗的相對信號強度。優(yōu)化后的螢光素酶報告基因可以成功地應用在各項生物研究領域中，例如對腫瘤壞死因子信號轉導的研究。腫瘤壞死因子是由單核- 巨噬細胞產(chǎn)生的能致腫瘤細胞壞死的活性因子，能加強中性粒細胞的吞噬和消化功能，促進其粘附于血管內皮和遷移出血管之外，并能激活轉錄因子NF- B調控的包括IL-1、GM-CSF在內的多種基因的表達。在外源表達NF- B螢光素酶報告基因的HEK293 細胞中，腫瘤壞死因子的刺激可以有效地使螢光素酶的表達提高1000 倍以上。同樣的檢測方法也可以成功地檢測腫瘤壞死因子阻斷劑對腫瘤壞死因子生物活性的阻斷效率(IC50=0.77 nmol)。
3 生物發(fā)光的其它應用
生物發(fā)光的強度取決于酶促化學反應中的各個反應成分的濃度，包括熒光素酶濃度、ATP濃度和螢光素酶底物即螢光素的濃度。通常，在生物發(fā)光的檢測體系中，如果保持其它成分的濃度過量且恒定，就可以檢測與生物活性相關的某個特定成分的濃度變化。我們上面談到的用螢光素酶作為報告基因來監(jiān)測基因轉錄活性的實驗，就是把螢光素酶濃度和基因轉錄活性直接關聯(lián)起來，螢光素酶濃度是我們的zui終監(jiān)測目標。此外，如果我們固定螢光素酶的濃度并使其過量，生物發(fā)光還可以用來監(jiān)測與ATP或螢光素濃度相關的生物學活性。
通過檢測螢光素的濃度來監(jiān)測某一生物學活性的實驗原理是：在螢光素上添加一個化學基團進行修飾，建立一個螢光素酶無法識別的"修飾"底物，而只有通過特定的生物反應切除這個化學基團，螢光素才能恢復活性，酶促反應才能發(fā)生，這樣我們就可以把生物發(fā)光的強度和這個特定的生物反應起來。Asp-Glu-Val-Asp-6'-aminoluciferin是一個沒有活性的螢光素衍生物，只有當半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(caspase-3)存在并切除這個四肽的序列，釋放出游離的螢光素時，螢光素酶酶促反應才能發(fā)生。因為半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶的活性是檢測細胞凋亡的一個重要指標，這樣的設計使生物發(fā)光成為一個有效的檢測細胞凋亡的手段。當然這一設計也可以用于運用熒光的細胞凋亡檢測上，即把同樣四肽的序列加到熒光染料Rhodamine110上。但由于生物發(fā)光*的低表達和高靈敏度，在相同的實驗條件下，運用生物發(fā)光研究細胞凋亡，其敏感性比運用熒光技術高將近一百倍。類似的設計也可以用來利用生物發(fā)光檢測其它蛋白酶的活性，比如caspase-8、caspase-9、二肽基肽酶Ⅵ(DPPIV)、caspase-3、鈣蛋白酶(calpain)、蛋白酶體(proteosome)等，并且還可以檢測其它如CYP450活性、單氨氧化酶等的酶促反應。
生物發(fā)光zui早用于檢測ATP的濃度，并且迄今為止仍然是快速檢測細胞活力zui廣泛使用的方法之一。與基于熒光的細胞活力檢測方法(如使用tetrazolium)相比，用生物發(fā)光來檢測哺乳細胞的生物活性，其敏感度要高達一百倍以上，而且只需要5 min。用生物發(fā)光來檢測細菌的生物活性，靈敏度非常高，細菌個數(shù)小于10時，都可以被檢測到。用生物發(fā)光檢測ATP的方法還可用于檢測消耗ATP的生物酶的濃度。以激酶為例，由于它可以作用于不同的磷酸鹽受體，包括蛋白、脂類和多糖底物，這種方法可以作為一個通用的檢測激酶活性的手段。zui近，我們利用cAMP對蛋白激酶A的調控和蛋白激酶A的激酶反應對ATP的消耗建立了一個檢測cAMP濃度變化的生物發(fā)光檢測方法。具體來說，細胞內cAMP的濃度可調節(jié)蛋白激酶A 的活性，而蛋白激酶A被激活后催化相應的磷酸化反應則需要消耗ATP，這樣一來細胞內ATP濃度就會降低，因此，我們檢測到的ATP的濃度就與蛋白激酶A的活性成反比，也與cAMP的濃度成反比。由于我們能夠將生物發(fā)光和ATP濃度直接關聯(lián)起來，所以我們建立了一個細胞內檢測G蛋白-偶聯(lián)受體活性或磷酸去脂酶活性的快速敏感的檢測方法。
4 結語
生物發(fā)光在復雜的生物有機體研究中具有巨大的潛力和價值。無論是它在很低的濃度下就可以發(fā)出清晰并定量的信號這一特性，還是它在哺乳細胞中低本底的優(yōu)點，都使得生物發(fā)光技術在揭示生命奧秘的過程中擁有*的地位。因此，生物發(fā)光檢測技術必將在基礎生命科學研究和新藥開發(fā)等諸多領域發(fā)揮越來越強大的作用。
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